螢光顯微鏡 OEM 相機
螢光顯微鏡是使用非常廣泛的術語,涵蓋許多應用。其範圍從生命科學的基本應用,到高度發展的技術,可使用特定高階硬體和軟體可檢測出數量很少的光子或單個分子,並加以定位。
選擇用於螢光顯微鏡的相機時,找到某些感光元件特性、相機相關層面,以及在科學、醫學與工業中所需應用的平衡,是十分重要的。
光學格式與解析度
當在可見光範圍內時,在格式、放大率和解析度方面,其光學設定和一般光源的顯微應用沒有太大差別。但很重要的一點是,當使用較大光學格式 (如 F-Mount) 時,其總體成本會增加。最常用的是 C-Mount,能提供相當好的光學表現,多數產品與解決方案的售價也很合理。對於開發小尺寸與低成本器材時,較小的 S-Mount 是個很好的選擇。要擷取最大的影像內容,通常選擇使用方型感光元件。
由於在影像系統中,感光元件扮演關鍵角色,因此在進行選擇時,考慮特定的性能規格,是十分重要的。
CCD、CMOS、SCMOS 和 BSI
長期以來,CCD 感光元件一直是螢光顯微鏡市場上的成熟技術。雖然在高品質顯微相機上仍可採用 CCD,但近年來情況發生變化。較新的 CMOS 技術近來來愈見普及,在科學領域特殊挑戰方面也更有競爭力。和傳統 CCD 感光元件相比,其雜訊位準已經相似甚至更低,同時帶來更快的速度、更高解析度和低耗電、低散熱需求,而且價格更低。
CMOS 感光元件仍在快速發展。一種稱為背照式的技術 (BSI) 已出現在工業用影像感光元件中。這種技術翻轉畫素結構,將對光敏感的光敏光電二極體直接置於微鏡頭下方,顯著提高素的量子效率。(圖 1)
單色或彩色
螢光應用通常偏好採用單色相機,因為其量子效率較高。造成這種差別的技術原因,在於彩色相機中每個畫素上的拜耳微濾鏡,只會讓特定波長光線通過。需要這道濾鏡,以一種稱為去拜耳的流程,來計算影像中的色彩資訊。因為彩色濾鏡會阻擋一部分的光線,因此到達畫素光子反應區的光子數量較少。除了感光元件上的拜耳圖樣外,彩色相機中的 IR 濾除濾鏡也是一種限制因素,因為它會阻擋波長約 650 - 700 nm 以上的光線。
一般來說,用來進行特定檢測的多螢光標記和共同定位特定分子的影像,是由使用單色相機取得的多張影像製作而成。可選擇的光源和濾波器組合,讓使用的每個螢光團擁有正確的激發和發射波長組合 (圖3) 。
然而,某些應用可能需要在單一儀器中僅使用單一相機來進行彩色成像和螢光。如果螢光應用的靈敏度要求不是太高,就有可能做到。
全域和滾動快門
CCD 感光元件只有一種快門類型 (全域),而 CMOS 感光元件則有兩種快門類型:滾動快門和全域快門。選對感光元件對影像品質帶來重大影響,特別是當目標物移動時。在滾動快門感光元件中,畫素是一行接一行進行曝光。因此,在兩行之間的訊號擷取過程中改變位置的物體,會造成影像的差異,帶來影像中的空間失真。滾動快門感光元件的技術優勢是畫素中電子元件較少,讀取時的雜訊較低。另一方面,全域快門感光元件上,所有的畫素在同一時間感光。在這種情形下,不同畫素行的曝光沒有時間差,因此物體移動不會造成空間失真。
感光度與動態範圍
在仔細查看影像品質前,確保系統感光度足以擷取螢光訊號是很重要的,在一些應用中這些訊號可能很微弱。感光度應該這樣理解:能產生足以與雜訊分別的訊號所需的最小光量。有個重要的數值稱為量子效率 (QE),描述光源入射光子和畫素產的電子之間的比率。這和波長相關,為得到最佳結果,指定感光元件的頻譜應該和應用中螢光團的發射頻譜相吻合。QE 愈高,光子產量愈高,曝光時間也能變短,可減少螢光團的光線漂白效應,並提高整體的成像速度。
通常,擁有較廣的光照強度也是有益的,可以透過一次曝光來解決。在此,也很重要。這個數值指一個畫素在一次曝光時可產生的最大電子數量。完整井容量愈大,畫素在飽和前可捕獲的光就愈多,降低因飽和需要額外曝光的需求。
結合最大電子數量與產生真實訊號所需的最小電子數量 (見下一節的「讀取雜訊」),動態範圍表示一台相機對不同程度光線的整體測量和區分能力。
最後,還有絕對敏感度閾值,這是一個畫素要產生訊噪比 (SNR) 為 1 時所需的光子數量,也就是訊號等於雜訊。該值愈小的話,產生真實訊號所需的光也愈小。由於這並沒有考慮素大小,因此當兩台相機畫素大小不同時,不能直接用來比較。
影像品質與雜訊
影像品質與雜訊
雜訊是真實訊號值與測量系統產生值之間的偏差。SNR 將成像系統在一定照度水平上的整體雜訊加以量化,是用於比較相機的常見參數。SNR 愈高,影像品質愈好。在成像過程中,有少數幾類雜訊一旦發生時,可透過相機技術予以降低 (例如由光子的實體出現而造成的光子/散粒雜訊)。然而,其他影響影像品質的雜訊類型,受感光元件與相機技術本身的顯著影響。近年來,前述的 CCD 技術在影像品質和性能方面,都被現代 CMOS 感光元件超越。讀取雜訊,或稱時序暗部雜訊,是在每個快門事件中加入的雜訊,以 e¯/pixel 表示。現代 CMOS 感光元件的讀取雜訊低至只有 2 e¯/pixel (圖 4)。
與螢光應用相關的另一個雜訊來源,在曝光時間增加時變得重要;該雜訊是由暗電流引起的。暗電流是由曝光期間電子的洩漏造成的,以 e ¯/pixel/s 表示 (圖 5)。據經驗法則,溫度提高 7 °C,暗電流會加倍。
非與時序相關,而與空間相關的雜訊類型稱為固定模式雜訊;這是在不同畫素之間看到的偏差。這可能是因為畫素電子或感光元件區域溫度不一致造成的。
這些雜訊類型的標準化量化測量是 DSNU (暗訊號非均勻性) ,描述沒有任何光訊號情形下產生的電子偏差;以及 PRNU (光反應非均勻性) ,描述畫素到畫素的偏差。在畫素到畫素的偏差上設置截止值,可以進一步區分並將值外畫素描述為有缺陷的畫素,例如熱畫素,會在沒有對應信號的情況下顯示高灰度值。某些相機製造商已經透過鄰近畫素的插值,以在品質控制期間修正有缺陷畫素,因此積分器不會受到其偽影的損害。
介面
市場上有多種不同介面。要決定需要哪個介面,應根據應用考慮以下幾點:資料/影像速率、纜線長度、標準化、整合的工作量與成本。USB 3.0 (更名為 3.2 Gen 1) 和 GigE 介面是整合到螢光顯微鏡系統的最新技術。兩種介面均可使用視覺標準,並提供由領導相機製造商定義的規格,以改善相機整合者的設計、投入資源與性能。
USB 3.2 Gen 1 是具備最簡單整合能力的傳統、成熟的隨插即用介面。其資料傳輸率可達 380 MB/s,也就是在 500 萬畫素時有 75fps,對大多數應用來說都夠用。 纜線長度可達數公尺長,也支援電源供應和多相機整合。當需要使用更長的纜線,且需要更精確的多相機同步時,採用 GigE。GigE 的頻寬比上述 USB 慢 3.8 倍 (100 MB/s)。對這兩種介面,已經發表了頻寬最高達到 4 倍的新版本。然而仍有待市場考驗,同時也需要對應硬體周邊的供應。
冷卻
感光元件的溫度對暗電流有極大影響,會造成 SNR 與影像品質劣化,特別是在光源訊號微弱,且需長時間曝光時更為嚴重。因此相機的冷卻可說相當重要,但在螢光成像中並非必要。由於冷卻措施會顯著提高系統成本,大多數相機不採用主動冷卻,對於具有良好螢光訊號的應用來說已經夠用。但即使在這類相機中,設計仍會影響感光元件溫度。應以低功耗來操作相機,以避免產生熱。此外,也應透過內部硬體設計,以及將相機安裝於散熱載體上,以有效將熱傳導至外界。
熱電 (帕耳帖) 元件可用於主動冷卻感光元件,且通常會有一個整合的風扇,以將帕耳帖元件的產熱對外散出。該風扇也可以在溫度降到低於環境溫度時,用以防止結露。如果系統必須防止振動 (可能來自風扇),某些相機甚至採用水冷系統。
透過韌體的改善
在硬體與感光元件規格以外,相機還可提供韌體功能,以改善低光狀態的影像品質。
一個例子是缺陷畫素校正。為此,製造商在最終檢驗時,以不同的曝光時間來操作相機,找到有缺陷的畫素,並儲存在相機的快取中。在操作模式下,有缺陷畫素的值,會由鄰近畫素的加權總和來進行插值。這可以改善影像品質與 SNR。
現今 CMOS 感光元件世代,可使過去無法實現的應用成真,而無需投資數千歐元在一台 CCD 相機上。這些新機會持續出現,因為可讓結構和過程可視化的螢光,在生命科學領域中的使用不斷增加。
現場的螢光
螢光是一種物理現象,而不僅是一種特定的技術。可能的方法–例如在生命科學中使用的分析,定量測定或可視化的方法–幾乎是無限的。螢光體可以耦合到各種載體上,如蛋白質 (通常是抗體)、核酸或微粒。也可以作為基因技術標記,整合進生物體內,以檢查細胞生物學功能和過程。除了生命科學之外,螢光方法也可用於其他領域,例如材料分析或法醫學。以下範例展現螢光的多功能應用選項。
在自體免疫性或傳染性疾病的體外診斷中,間接免疫螢光顯微鏡技術,可用於檢測患病血液中的特定抗體。
除了手動顯微鏡外,也已有自動化系統,可讓實驗室醫生基於與患者血清培養的細胞螢光模式,依照軟體的評估,提供其建議與發現 (圖 6)。另一個系統則可在 3 分鐘內,分析出患者的瘧疾病原體血清。該分析使用視覺演算法進行,該演算法還考慮了螢光訊號
定點照護系統在醫療診斷,重要性與日俱增。除了其他優點外,該系統具備簡單且價格平實的應用,可在經濟弱勢與基礎設施較差的地區,提供更好的醫療照護。微型實驗室技術可在小型晶片上處理病患檢體,無需複雜的實驗器材。
在手術顯微鏡中,外科醫生更加受惠受於血管或腫瘤組織的特定螢光標記,使之能夠透過螢光手術引導,以完美的精確度進行手術。牙醫在治療期間可以選擇性地將受蛀牙影響的牙齒區域可視化,以提供更快速,更具體的治療。還有一點也很重要,就是在病理學中應用螢光顯微鏡,可檢查患者活體組織的可能疾病。
生命科學提供了廣泛的螢光應用,其中顯微鏡檢查扮演吃重的角色。免疫螢光顯微鏡可用以進行特定蛋白質的特定檢測;例如,檢測或澄清其在細胞和組織中的位置,或標記出細胞正在開始死亡的區域,這取決於特定測試條件 (圖 7)。現今也可以在自動化系統上,進行更長時間的活細胞成像。
小型化和平行化以增加分析數量,在藥物研究中尤為重要,因為在尋找新的活性物質時,需對大量樣品進行分析篩選。這時微陣列和高內涵篩選系統就會派上用場 (圖 8)。
通過自動菌落計數器,螢光標記可以用於培養皿中,以選擇成功轉染的細胞,隨後選擇對應菌落的樣本。亦即可驗證特定遺傳物質是否作為實驗的一部分實際轉移到細胞中,研究人員可以繼續將其用於研究。